Castruccio Castracani per motivi di comodità, di sicurezza ma anche di prestigio aveva dotato il Palazzo di una cappella interna per le funzioni religiose, che si trovava all’ultimo piano dell’ala est dove oggi sorge la Galleria di Ammannati. Questa cappella rimase in uso anche per gli Anziani e per il Gonfaloniere che nei due mesi di mandato non potevano lasciare liberamente il Palazzo. Nel XVI secolo, con le ristrutturazioni la cappella fu spostata nella zona verso San Romano, adiacente agli appartamenti del Gonfaloniere degli Anziani. Nel 1531 fu decorata con gli stalli lignei intarsiati dai fratelli Ambrogio e Nicolao Pucci e successivamente fu arricchita da cinque tele, tre delle quali sono ancora conservate nel museo di Villa Guinigi: "La natività di Cristo" di F. Zuccari, "La Visitazione" di B. Franco, "La natività della Vergine" di B. Neroni detto il Riccio. La messa che vi si celebrava quotidianamente era spesso accompagnata dalle esecuzioni vocali e strumentali della Cappella Musicale.
La Cappella fu smantellata da Elisa Bonaparte Baciocchi per realizzare l’ultima sala del Quartiere del Trono.